PESQUISA VETERINÁRIA BRASILEIRA

Abstract in English:

ABSTRACT.- Cruz T.F., Kanashiro T.M., Castro A.M.M.G., Baldin C.M., Richtzenhain L.J. & Araujo Jr J.P. 2016. A double-antibody sandwich ELISA based on the porcine circovirus type 2 (PCV2) propagated in cell culture for antibody detection. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(12):1171-1177. Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: jpessoa@ibb.unesp.br, tfcruz@yahoo.com.br Few studies have described enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) for the detection of antibodies against porcine circovirus type 2 (PCV2) based on antigens produced in cell culture. Furthermore, few articles have described viral purification techniques for members of the family Circoviridae. This occurs because circoviruses are difficult to isolate, noncytopathogenic, and produce low viral titres in cell culture. Thus, for overcoming these difficulties in the cultivation of PCV2, this study aimed to develop a double-antibody sandwich ELISA based on the cell culture antigen PCV2b for the quantification of anti-PCV2 antibodies. A 20% and 50% discontinuous sucrose cushion was used for viral purification, which enabled the separation of cell culture proteins in the 20% sucrose cushion and a greater viral concentration in the 50% sucrose cushion. Following isopycnic centrifugation, PCV2 was concentrated in the band with density values from 1.330 to 1.395g/cm3. Viral purification was assessed using SDS-PAGE, indirect ELISA and electron microscopy. The standardised ELISA revealed a strong linear correlation (r= 0.826, p<0.001) when compared with a commercial ELISA kit. The assay exhibited low variability (inter-assay coefficient of variation of 4.24% and intra-assay of 1.80%) and excellent analytical specificity conferred by the capture antibody produced in rabbit. Thus, this ELISA is a rapid, specific and convenient method for the detection of antibodies against PCV2 in studies of experimental and natural infection, and in monitoring the response to vaccination on commercial farms.

• Immunosorbent assay centrifugation porcine circovirus type 2 antibody

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Cruz T.F., Kanashiro T.M., Castro A.M.M.G., Baldin C.M., Richtzenhain L.J. & Araujo Jr J.P. 2016. A double-antibody sandwich ELISA based on the porcine circovirus type 2 (PCV2) propagated in cell culture for antibody detection. [Sandwich ELISA com duplo anticorpo baseado no circovirus suíno tipo 2 (PCV2) produzido em cultivo celular para detecção de anticorpos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 36(12):1171-1177. Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: jpessoa@ibb.unesp.br, tfcruz@yahoo.com.br Há poucos relatos na literatura de métodos de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), para a detecção de anticorpos contra o circovírus suíno tipo 2 (PCV2), baseados em antígenos produzidos em cultivo celular, bem como uma escassez de trabalhos descrevendo técnicas de purificação viral para os membros da família Circoviridae. Isso ocorre, pois os circovírus são de difícil isolamento, não causam efeito citopático e produzem um baixo título viral em cultivo celular. Assim, para superar essas dificuldades encontradas no cultivo do PCV2, este estudo objetivou desenvolver um sandwich ELISA com duplo anticorpo, baseado no antígeno de PCV2 produzido em cultivo celular, para a quantificação de anticorpos anti-PCV2. Um colchão de sacarose descontínuo a 20% e 50% foi utilizado para a purificação viral, o qual possibilitou a separação das proteínas oriundas do cultivo celular no colchão de sacarose a 20% e uma maior concentração viral no colchão de sacarose a 50%. Com a ultracentrifugação isopícnica, o PCV2 ficou mais concentrado na banda com valores de densidade de 1,330 a 1,395g/cm3. A purificação viral foi avaliada pelas técnicas de SDS-PAGE, ELISA indireto e microscopia eletrônica. Assim, o método de ELISA padronizado revelou uma forte correlação linear (r = 0,826, p <0,001) quando comparado com um kit de ELISA comercial. O ensaio demonstrou baixa variabilidade (coeficientes de variação inter-teste de 4,24% e intra-teste de 1,80%) e uma excelente especificidade analítica conferida pelo anticorpo de captura produzido em coelho. Portanto, o método de ELISA demonstrou ser rápido, específico e conveniente para a detecção de anticorpos contra o PCV2 em estudos de infecção natural e experimental, além da monitoria da resposta à vacinação contra o PCV2 em granjas comerciais.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Basso R.M., Oliveira-Filho J.P., Palumbo M.I.P., Zakia L.S., Araújo Jr J.P. & Borges A.S. 2015. [Occurrence of DNM1 SNP c.767G>T responsible for exercise-induced collapse in Labrador Retriever in the Sao Paulo state.] Ocorrência do SNP c.767G>T no gene DNM1 responsável pelo colapso induzido pelo exercício em cães da raça Labrador Retriever no Estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira 35(5):486-490. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Junior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: asborges@fmvz.unesp.br The exercise-induced collapse (EIC) is considered an autosomal recessive syndrome that mainly affects Labrador Retriever dogs. The disease is characterized by muscle weakness and collapse after intense exercise. Recovery usually occurs after exercise but some animals may die. The clinical signs occurs due to the single-nucleotide polymorphism (SNP) c.767G>T in Dynamin 1 (DNM1) gene. The aim of this study was to evaluate the occurrence of this SNP in 321 Labrador Retriever dogs from São Paulo state. Specific primers for amplification of the entire exon 6 of the DNM1 gene were used in a PCR performed with DNA from blood or buccal swab samples, direct sequencing was performed for the final evaluation. Among 321 animals studied, 3.4% (11/321) of animals were homozygous for the DNM1 SNP (c.767G>T) and 24.6% (79/321) were heterozygous. Only one of the 11 homozygous animals in this study had previous clinical signs compatible with this disease. This is the first study that evaluated the occurrence of DNM1 SNP (c.767G>T) gene in Brazil and considering that almost 25% of the studied animals were heterozygous, the routinely evaluation of this SNP may be important before this breed mating The EIC should be include in the differential diagnosis of neuromuscular diseases in Labrador Retriever dogs.

• Labrador Retriever exercise exercício

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Basso R.M., Oliveira-Filho J.P., Palumbo M.I.P., Zakia L.S., Araújo Jr J.P. & Borges A.S. 2015. [Occurrence of DNM1 SNP c.767G>T responsible for exercise-induced collapse in Labrador Retriever in the Sao Paulo state.] Ocorrência do SNP c.767G>T no gene DNM1 responsável pelo colapso induzido pelo exercício em cães da raça Labrador Retriever no Estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira 35(5):486-490. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Junior s/n, Botucatu, SP 18618-970, Brazil. E-mail: asborges@fmvz.unesp.br O colapso induzido pelo exercício (EIC) é considerado uma síndrome autossômica recessiva que afeta principalmente cães da raça Labrador Retriever. A doença é caracterizada por fraqueza muscular e colapso após exercício intenso. Usualmente, ocorre recuperação clínica após o episódio, mas alguns animais podem vir a óbito. Os sinais clínicos são decorrentes do polimorfismo de base única (SNP) c.767G>T no gene Dynamin 1 (DNM1). O objetivo deste trabalho foi determinar a ocorrência deste SNP em 321 cães da raça Labrador Retriever do Estado de São Paulo. Primers específicos para a amplificação de todo o exon 6 do gene DNM1 foram usados nas PCRs utilizando DNA a partir de amostras de sangue ou swab bucal, a avaliação final foi realizada com sequenciamento direto dos produtos da PCR. Dentre os 321 animais estudados, 3,4 % (11/321) eram homozigotos para o SNP c.767G>T no gene DNM1 e 24,6% (79/321) eram heterozigotos. Somente um dos 11 animais homozigotos apresentavam sinais clínicos compatíveis com a EIC. Este é o primeiro estudo sobre a ocorrência deste SNP no Brasil e considerando que quase 25% dos animais estudados eram heterozigotos, a genotipagem dos animais para este SNP pode ser importante antes dos acasalamentos para cães desta raça. A EIC deve ser considerada nos diagnósticos diferenciais de enfermidades neuromusculares em cães da raça Labrador Retriever.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Oliveira-Filho J.P., Badial P.R., Cunha P.H.J., Bordon A.P., Araujo Jr J.P., Divers T.J., Winand N.J. & Borges A.S. 2014. Freund’s adjuvant-induced inflammation: clinical findings and its effect on hepcidin mRNA expression in horses. Pesquisa Veterinária Brasileira 34(1):51-56. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-000, Brazil. E-mail: zefilho@fmvz.unesp.br Hypoferremia observed during systemic inflammatory disorders is regulated by hepcidin. Hepcidin up-regulation is particularly important during acute inflammation, as it restricts the availability of iron, which is necessary for pathogenic microorganism growth before adaptive immunity occurs. The aim of this study was to evaluate the clinical findings and hepatic hepcidin mRNA expression in horses using a Freund’s complete adjuvant (FCA) model of inflammation. The expression of hepcidin mRNA in the liver was determined in healthy horses following two intramuscular injections of FCA at 0 h and 12 h. Plasma iron and fibrinogen concentrations were measured at multiple time points between 0 h and 240 h post-FCA injection (PI). Hepcidin mRNA expression was determined by RT-qPCR using liver biopsy samples performed at 0 h (control), 6 h and 18 h PI. The mean plasma fibrinogen level was significantly different from the control values only between 120 and 216 h PI. The mean plasma iron level was significantly lower than the control between 16 and 72 h PI, reaching the lowest levels at 30 h PI (33 % of the initial value), and returned to the reference value from 96 h PI to the end of the experiment. Hepcidin mRNA expression increased at 6 h PI and remained high at 18 h PI. The iron plasma concentration was an earlier indicator of inflammatory processes in horses when compared with fibrinogen and might be useful for the early detection of inflammation in the horse. FCA administration caused the rapid onset of hypoferremia, and this effect was likely the result of up-regulated hepatic hepcidin gene expression. This study emphasizes the importance of hepcidin and iron metabolism during inflammation in horses.

• Hepcidin Freund’s adjuvant Hepcidina Adjuvante completo de Freund

Abstract in Portuguese:

RESUMO.- Oliveira-Filho J.P., Badial P.R., Cunha P.H.J., Bordon A.P., Araujo Jr J.P., Divers T.J., Winand N.J. & Borges A.S. 2014. Freund’s adjuvant-induced inflammation: clinical findings and its effect on hepcidin mRNA expression in horses. [Inflamação induzida por Adjuvante de Freund: achados clínicos e efeitos sobre a expressão do RNAm da hepcidina em equinos.] Pesquisa Veterinária Brasileira 34(1):51-56. Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista, Campus de Botucatu, Distrito de Rubião Júnior s/n, Botucatu, SP 18618-000, Brazil. E-mail: zefilho@fmvz.unesp.br A hipoferremia observada durante os processos inflamatórios sistêmicos é mediada pela hepcidina. O aumento da expressão da hepcidina é particularmente importante durante a inflamação aguda, por restringir a disponibilidade de ferro necessária para o crescimento de microrganismos patogênicos antes que a imunidade adaptativa ocorra. O objetivo deste estudo foi avaliar os achados clínicos e a expressão hepática do RNA mensageiro (RNAm) da hepcidina em cavalos após a indução da inflamação com Adjuvante completo de Freund (FCA). A expressão hepática do RNAm da hepcidina foi determinada em cavalos sadios após duas administrações intramusculares de FCA às 0 h (M0) e 12 h (M12). As concentrações plasmáticas de ferro e fibrinogênio foram mensuradas em múltiplos momentos entre 0 h e 240 h (M240) após a primeira administração de FCA (PI). A expressão do RNAm da hepcidina foi determinada por RT-qPCR usando amostras de biopsias hepáticas colhidas as 0 h (controle), 6 h (M6) e 18 h (M18) PI. A concentração plasmática média de fibrinogênio foi estatisticamente diferente do M0 entre 120 h e 216 h PI. A concentração plasmática média de ferro foi significantemente menor que o controle entre 16 h e 72 h PI, alcançou o nível mais baixo às 30 h PI (33% do valor inicial) e retornou aos valores de referência entre 96 h PI e até o final do experimento. A expressão do RNAm da hepcidina aumentou no M6 e permaneceu alta no M18. A concentração plasmática de ferro foi um indicador precoce da inflamação quando comparada com o fibrinogênio e pode ser útil na detecção precoce da inflamação em cavalos. A administração do FCA causou um rápido início da hipoferremia, e isto foi resultante do aumento da expressão hepática da hepcidina. Estes resultados enfatizam a importância da hepcidina e do metabolismo do ferro durante a inflamação em cavalos.

Abstract in English:

ABSTRACT.- Lara V.M., Sueli Akemi Taniwaki S.A. & João Pessoa Araújo Jr J.P. 2007. [Phylogenetic characterization of feline immunodeficiency virus (FIV) isolates from the state of São Paulo.] Caracterização filogenética de amostras do vírus da imunodeficiência felina (FIV) do Estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira 27(11):467-470. Departamento de Micro-biologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo 18618-000, Brazil. E-mail: jpessoa@ibb.unesp.br Feline immunodeficiency virus (FIV) is a lentivirus associated with immunologic disorders in domestic cats. Due to the high genetic variability of FIV, five subtypes (A to E) have been identified and diversity within each subtype is also frequent. The study of the genetic diversity can aid the understanding the pathogenesis and epidemiology of the disease. Therefore, the present work aimed to analyze phylogenetically FIV isolates of domestic cats from the state of São Paulo, Brazil. The sequencing of 658 bp of the gag gene from 23 samples was performed and the results were analyzed using the Tamura-Nei nucleotidic substitution method. The phylogenetic analysis showed that all viruses belong to subtype B, and clearly three subgroups were present within this subtype. Additionally, these results suggest a common ancestor between the FIV strains derived from Japan and one Brazilian virus. In conclusion, this work presents the first information about the genetic diversity of FIV in the state of São Paulo. Additional studies are necessary to characterize the real scenario of the distribution of FIV subtypes in the population of Brazilian cats.

• Cat subtype FIV phylogeny genotyping

Abstract in Portuguese:

ABSTRACT.- Lara V.M., Sueli Akemi Taniwaki S.A. & João Pessoa Araújo Jr J.P. 2007. [Phylogenetic characterization of feline immunodeficiency virus (FIV) isolates from the state of São Paulo.] Caracterização filogenética de amostras do vírus da imunodeficiência felina (FIV) do Estado de São Paulo. Pesquisa Veterinária Brasileira 27(11):467-470. Departamento de Micro-biologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo 18618-000, Brazil. E-mail: jpessoa@ibb.unesp.br Feline immunodeficiency virus (FIV) is a lentivirus associated with immunologic disorders in domestic cats. Due to the high genetic variability of FIV, five subtypes (A to E) have been identified and diversity within each subtype is also frequent. The study of the genetic diversity can aid the understanding the pathogenesis and epidemiology of the disease. Therefore, the present work aimed to analyze phylogenetically FIV isolates of domestic cats from the state of São Paulo, Brazil. The sequencing of 658 bp of the gag gene from 23 samples was performed and the results were analyzed using the Tamura-Nei nucleotidic substitution method. The phylogenetic analysis showed that all viruses belong to subtype B, and clearly three subgroups were present within this subtype. Additionally, these results suggest a common ancestor between the FIV strains derived from Japan and one Brazilian virus. In conclusion, this work presents the first information about the genetic diversity of FIV in the state of São Paulo. Additional studies are necessary to characterize the real scenario of the distribution of FIV subtypes in the population of Brazilian cats.